色谱柱的使用寿命，除了与所分析的样品和流动相及使用频率有关系外，最主要的是与日常的维护密切相关。为延长色谱柱的使用寿命，维护您的利益，请仔细阅读此部分。
色谱柱的使用寿命主要是柱效和柱压两个指标来衡量，如果一支色谱柱柱效太低或柱压太高，通常被认为该色谱柱已经结束。因此，延长色谱柱使用寿命的关键是，消除引起柱效下降和柱压升高的因素。以下是色谱柱的日常维护方法：
一、流动相的PH应在使用的范围内
Welch公司的色谱柱除反相氰基柱PH1.5-9.0外，其反相色谱柱的PH范围均为1.5-10，由于填料中存在Si-C和Si-O键，流动相超过其PH范围将会导致硅胶基质流失和键合相碳链断裂，使柱效下降，使用寿命变短。由于流动相的PH 控制不当而对色谱柱造成的损害，通常很难使色谱柱恢复，因此必须认真对待，严格控制流动相的PH值。
二、去除样品和流动相中的固体颗粒
样品和流动相中含有的固体颗粒物质会堵塞色谱柱筛板，筛板被堵住不仅会引起柱压的升高，而且也会引起柱效下降，因为筛板的堵塞会引起液流不均，导致色谱峰型拖尾、变宽，从而使柱效下降。因此，建议使用超纯水和色谱纯试剂，在分析样品前对样品进行针筒过滤，流动相过0.45μm滤膜。
三、使用保护柱或在线过滤器
样品和流动相经过滤后并不能完全消除固体颗粒物质，因为泵的磨损、密封圈和管路的老化也会产生固体颗粒物质，这些固体颗粒被流动相带入色谱柱，堵塞筛板，导致柱压升高、柱效下降。保护柱和在线过滤器上都有筛板，其孔径与色谱柱孔径相同，因此可以阻止固体颗粒物质到达色谱柱，有效防止色谱柱筛板的堵塞。由于柱压升高在分析故障中占很大 比例，因此，除对样品和流动相进行过滤外，建议您在色谱柱进样端加上保护柱或在线过滤器。
如果确认色谱柱柱压升高是由于进样端筛板被堵引起的，可选择以下方式进行补救：
1、先在色谱柱前加上保护柱或在线过滤器，然后用甲醇、水=20/80ml/min反向冲色谱柱180min。
2、先在色谱柱进样端加上保护柱或在线过滤器，然后反向使用。
四、正确使用缓冲盐
缓冲盐通常易溶于水，难溶于有机溶剂，因此缓冲盐使用不当会使其析出，堵塞填料基质上的微孔和颗粒间的空隙，使填料板结，柱压上升；同时阻碍了基质上键合的碳链自由舒展，使色谱柱的保留能力下降，柱效降低。缓冲盐析出后，去除非常困难，因此，正确的使用缓冲盐对延长色谱柱使用寿命非常重要。
正确使用缓冲液的目的是防止缓冲盐析出，因此正确使用缓冲盐的方法可归结为一句话：使用前要过滤，使用后要冲洗。具体方法如下：
1、等度条件：使用缓冲盐前和使用后需用过渡流动相以1.0ml/min流速冲洗60min；使用后去除缓冲盐的另一个方法是用过渡流动相以0.2ml/min流速冲洗色谱柱过夜。
2、梯度条件：用含有缓冲盐的流动相跑梯度之前，用与初始流动相组成相同的过渡流动相以1.0ml/min流速冲洗60min，再用该过渡流动相以1.0ml/min冲洗色谱柱120min。含缓冲盐流动相的梯度设定应尽量平缓，以避免梯度过程中缓冲盐析出。
注意：过渡流动相是指有机相和水相的组成与分析流动相相同，区别只是过渡流动相不含缓冲盐。
3、缓冲盐析出的补救方法：
1）方案1：用甲醇/20/80以1.0ml/min流速35摄氏度条件下反向冲洗色谱柱120min
2）方案2：用甲醇/水=20/80以0.2ml/min流速反向冲洗色谱柱过夜。
五、防止强保留物质在色谱柱上存留
强保留物质和大分子化合物在色谱柱中累积，对样品中的化合物产生额外的保留行为，不仅引起峰型变宽、拖尾，使柱效下降，同时也会引起保留时间的变化，累积到一定程度时还会导致柱压升高。由于强保留物质和大分子化合物对色谱分离的影响是一个累积效应，需要一定的时间才会体现出来，但对许多药品特别是复杂样品而言，很难判断其是否是含有强保留物质，因此要防止强保留物质的累积，需要在每天的日常维护中用纯甲醇或乙氰清洗色谱柱。
清洗方法：
1、未使用缓冲盐：每天分析完成后，先用上述方法除去缓冲盐，然后再用甲醇或乙氰反向冲洗色谱柱60min。
2、使用过缓冲盐：分析完成后，先用上述方法除去缓冲盐，然后在用纯甲醇或乙氰反向冲洗色谱柱60min
3、补救方法：
水——乙氰——氯仿（或异丙醇）——乙氰——水
每一步以1.0ml/min流速反向冲洗色谱柱60min。
C18色谱柱的选用、保养与维修 kk7: A0._
据统计，近80%的有机物及无机物可以用高效液相色谱法进行分离，其中反相色谱中的C18色谱柱是高效液相色谱中最为常用的一类色谱柱。下面就C18色谱柱的选用、保养与维修作一介绍。 kp>Z/kt
1、C18色谱柱的选用
C18的选用主要考虑2个问题，即柱填料和柱规格对色谱柱的影响。 ~E|V{z%
1.1 C18柱的填料对色谱柱的影响 柱填料的物理性能对填料色谱行为有重要影响。填料主要的物理性能包括如下：颗粒度、孔径、孔体积、键合相化学、含碳量及烷基化处理。 wdDHRW0Y
(1)颗粒度是指柱填料的颗粒直径的大小。实际上色谱柱上所标的粒径是一个平均值。如粒径“5μm”并不是柱中填料所有的颗粒直径都是5μm，实际上有一个颗粒分布度。这种分布度对柱反压及柱效有重要作用。一般来说，平均颗粒度越小，颗粒分布度越小，色谱柱效越高，反压亦越高。目前C18柱填料粒径在4～10μm之间。 r%mTOLef
(2)孔径是指填料颗粒间的孔间隙。一般所说的孔径是指填料的平均孔径。球形填料装柱后平均孔径分布比较窄，柱床结构均匀，柱效高，重现性好；无定形填料平均孔径分布较宽，柱床结构不均匀，流动相线性速度不均匀，谱带扩宽。平均孔径的大小对分离大分子化合物有较大的影响，在分离含有较大分子的样品时可能会有分子排阻效应，或产生吸附效应从而影响定量的回收率及准确度。因而在用反相色谱分离诸如蛋白或多肽样品时应考虑选用大孔径(如30 nm)的反相柱填料。孔体积作为硅胶多孔性的参数，在分离分析较大分子化合物时可作参考，选用较大孔体积的反相柱填料。 h9smviU7u
(3)化学键合相填料在高效液相色谱法中占有极重要的地位。它可以键合极性较大的有机基团，采用极性较小的溶剂作流动相。亦可键合极性较小的有机基团，选用极性较大的溶剂作流动相。C18色谱柱是以硅烷化键合型(Si-O-Si-C)存在的，这类键合反应目前应用最为普遍。如以十八烷基三氯硅烷与全多孔型硅胶M-Porasil-C18反应生成烷基化学键合相，商品名为M-Bondapak-C18。 !OVEA^6‑
(4)碳含量即填料中的含碳量。传统的测量技术是将填料加热到碳氢键断裂，然后通过测定损失的重量或形成的二氧化碳来计算碳含量。可以通过增加碳键的长度或增加键合密度来增加碳含量。碳含量增加，柱子的保留值增加。键合相的色谱行为与键合密度有关，也与硅胶的密度及填料的表面积有关，填料的密度越高，填柱所需的硅胶量越多，柱子的含碳量也越高。如果用2种不同密度相同碳含量的填料填充柱子，其保留行为将明显不同。因此，单独以碳含量来预测色谱行为是不够的。 P&`r87J
(5)C18硅烷化试剂是一个大于2 nm大分子，因此会与已键合在相邻的硅醇基上的C18硅烷化试剂产生严重的立体位阻。其结果导致在硅胶表面有大量的残留硅醇基没有与硅烷化试剂反应，这些极性的硅醇基在一定色谱条件下会与碱性化合物相互作用引起峰形拖尾，从而可影响定量分析结果。这些问题在一定程度上可以通过烷基化处理加以克服。烷基化处理是在键合相上完成的独立反应，以减少在硅胶表面的硅醇基。烷基化处理采用小分子(如三甲硅烷)的试剂，其空间位阻远小于C18基团。大多数固定相仅有30%可覆盖的键合位置。据报道，通过某些极活跃的化学试剂及特殊的反应条件，最高的覆盖量可达50%。很好地了解硅胶键合相的物理特性将有助于在高效液相色谱的反应中选择合适的色谱柱。表面上看C18柱虽然化学官能团相同，而实际上不同品牌的C18柱性能可能有很大差别，从而产生不同的分离结果。 yQ&%* ?J
1.2 C18柱的规格对色谱柱的影响 柱填料的选择关系到色谱分离的可能性，而柱规格的选择直接影响分析速度、分离能力、检测能力及每次分析的溶剂消耗等。柱规格包括两方面：柱内径和柱长度。柱内径，分析型一般为2～6 mm,制备型20 mm，大者可达80 mm；柱长度，分析型5～30 cm，制备型15～50 cm。一般来说，柱内径不影响分离度与分析时间的关系。今天，柱技术已发展到不同柱内径的柱子能够具有相同的性能。不同内径的柱子又各具特点，对相同的分析时间和分离度来说，内径大的柱子比内径小的柱子多消耗溶剂。另一方面，较小内径的柱子对相同的检测信号来说所需样品量亦较少。因此，在样品量有限时，可使用小内径柱。柱长度增加虽可改善分离效果，但阻力也随之增加，必须提高入口压力。柱压是同时影响增加分离度和减少分析时间的主要障碍。分离度、分析时间及柱压三者相互制约，选择好其中两者，则第3个因素也就选好了。长柱可以给出高分离度，短柱可提供快速分离，我们可以根据样品情况去选用合适的色谱柱。 (SVr>|Db
1.3 C18柱选用的基本原则 (1)选用经过烷基化处理封口的填料可防止碱性化合物的拖尾现象。(2)选用含碳量高的柱子，增加保留值。(3)选用较短的柱子(如15 cm，7.5 cm)。(4)选用小颗粒度的填料。(5)对分子量大的组分选用大孔径填料的柱子。 >^HTg
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2、C18色谱柱的日常使用与保养 F@K;A%us)
在日常分离分析工作中，色谱柱使用是否得当，直接影响色谱柱的寿命。下面介绍C18柱在日常使用过程中应注意的事项。 BtApl)q#
(1)柱子在装卸、更换时，动作要轻，接头拧紧要适度。必须防止较强的机械振动，以免柱床产生空隙。 Hxi=\2-
(2)如果仪器用来做常规分析，样品种类有限，但分析次数多，则不妨为每一类常规分析配置1根专用柱，这样有助于延长柱子的寿命。 *lF%8k
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(3)如使用柱温控制装置时，应注意在通入流动相后才能升温。 4x=Y9w0?8
(4)流动相使用前需进行脱气处理，以免降低柱效和影响检测等。样品溶液需经适当的前处理及过滤，以减少柱污染和堵塞。 [1]#;]F:TlR
(5)在更换流动相种类时，应注意溶剂的互溶性，防止发生盐析现象。
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(6)柱子的实际操作压力应低于填装时的最高压力，最好在最高压力一半以下。一般不超过20 593.965～29 419.95 kPa。在低压力(≤14 709.975 kPa)的范围使用，可使柱保持长时期的高柱效。 xhS/X3<th
(7)C18色谱柱属非极性键合相色谱柱，流动相的pH值应严格控制在2～7之间，以免损坏柱子。 H;&t"Ql.
(8)在完成分离分析工作之后，不应立即停机，需及时对色谱分析系统进行冲洗，一般0.5 h以上，以除去色谱柱内的杂质。 >f8,Y
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(9)如果流动相中有盐类，首先用水充分清洗。如果是胺类(如三甲胺类或四丁基胺类)添加到流动相中，要用50%甲醇和0.05%磷酸溶液混合溶剂冲洗，不要只用水冲洗。 [nD4\ x+
(10)C18一般用100%甲醇作为保存溶剂，以防柱子干裂而损坏。严禁水或缓冲溶液长时间在色谱流路中保留。 l/NK.Jr
(11)选用合适的C18保护柱，以保护分析柱免受杂质颗粒及不可逆吸附的干扰物的影响。保护柱内装填料颗粒度应与分析柱填料的颗粒度尽量一致。 3zHiu*2/!
(12)柱的保存期不宜太长。短期不用的C18柱，用甲醇冲洗30～60 min，然后将柱两端密封。较长期不用的柱子，一是采取定期冲洗，再密封的方法；二是在冲洗后，柱两端各装1只有一定容量的灌满甲醇的容器(只装一端也可)，以补充在较长存放期间柱内溶剂的蒸发。
3、C18色谱柱的维修 &nP rozC
色谱柱在日常使用过程中，尽管保护严格，样品和流动相尽管经过前处理，但经过长时间的使用，仍然难以完全避免柱子受到污染，固定相流失、板结、柱床塌陷以及柱效下降等。有些可以通过维修，使部分柱效恢复。 V|7CYkB8
3.1 柱污染再生技术 色谱柱污染后，可以用合适的溶剂冲洗，使柱效再生。C18柱常规的再生洗涤方法是：分别用甲醇、三氯甲烷、甲醇/水各60 mL依次通过色谱柱，再用100%甲醇60 mL平衡色谱柱后封存，柱效将恢复正常。必要时，根据柱污染性质(如有机污染、盐类污染等)，采用0.05 mol/L H2SO4、0.5 mol/L H3PO4或0.1 mol/L EDTA钠盐冲洗，然后再用水冲洗，最后用100%甲醇平衡色谱柱后封存。对于严重污染的C18柱，可采用水、甲醇、氯仿、乙烷依次冲洗后，按顺序倒过来再冲洗1次，每次所用溶剂60 mL，不接检测器，最后用100%甲醇平衡色谱柱封存。 (J*0/7 eX
3.2 柱污染的修复 在柱污染再生无效或已知柱污染严重时，可以采用柱修补的方法解决，但柱污染深度不宜超过5 mm。方法是将特制小铲将污染部分挖去，再用与柱填料相同的固定相与流动相混合制成浆状，然后将浆状固定相仔细补入被挖去的部分(尽量使后填补的固定相接近原装的紧密程度)，修平端面即可。修好的柱子如果柱头两端的筛板的孔径是一致的，可将柱子颠倒过来使用一般时间，目的是借助流动相冲洗作用，恢复柱床紧密程度。 hNy S
3.3 柱塌陷的修复 柱塌陷的原因很多。对于塌陷不太严重时，如果柱头两端的筛板孔径是一致的，可将柱颠倒使用一般时间，即可恢复性能。当塌陷严重(5 mm左右)时，可采用柱污染的修复方法修补即可。
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